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Con la llegada de los españoles no cambiaron las actividades en Iquique. En 1556, cuando se inicia la explotación del mineral de plata de Huantajaya, Iquique serviría solo de puerto de desembarque de trabajadores y aventureros, y de descarga de productos de primera necesidad con destino al mineral, principalmente agua, concentrándose la actividad comercial en el propio yacimiento. La aldea de Iquique, en esta época, jamás cumpliría la función de "puerto de la plata". Parte importante del mineral extraído era conducido directamente a Carangas, donde era acuñado, enviándose luego vía terrestre a Arica y Tacna donde estaban las Cajas Reales. En Tacna era revisado por el balanzario, ensayador y fundidor. La abundancia de piratas y corsarios en la costa del Virreynato hacían esta práctica necesaria. En 1574 Francis Drake asoló la aldea de Iquique, pudiendo encontrar solo trece barras de plata.

A diferencia de Huantajaya que recibía a miles de personas, la actividad del naciente puerto de Iquique se limitaba al envío a Tacna y Arica de brea explotado en la isla Serrano. Las visitas de navegantes extranjeros consigna una poblacion alrededor de 20 a 30 personas.
En el aporte conjunto de Iquique, Arica y Pica al erario del Rey, en 1785 el puerto aportó poco más de un veinte por ciento del total; en 1793 la contribución bajaría al quince y en 1804 a solo el siete por ciento del total recaudado.

A finales del siglo XVII ademas de la actividad pesquera y guanera funcionaban una molienda y una reducida aduana. Las limitaciones se debian a la extrema sequedad del entorno y ausencia absoluta de agua, obligando a transportarla desde Pisagua o Arica, siendo vendida a precios exorbitantes. De igual manera los alimentos. En 1600 Oliverio van Noort saqueó el pueblo, incluida su capilla.

Las revoluciones independendistas tambien influenciaron a Iquique. En 1781, a raíz de la revolución del cuzqueño Tupac Amaru, la población extranjera residente en el interior se refugió en Iquique a la espera de un barco que los alejase de la zona, mientras eran hostilizados por los sublevados. La situación se repetiría en 1808, a raíz de una insurrección militar de un comandante español en Tarapacá, y en 1815, como consecuencia de la rebelión en Tarapacá liderada por el cacique Choquehuanca.

Respecto a los tributos de la zona, se sabe que en 1628 el conde de Monterrey, asignado a la encomienda de Tarapacá, Sibaya, Iquique y los puertos del Loa, tenía derecho a recibir un tributo anual de dos pesos oro por persona monto que equivalía a la mitad del ingreso anual de un trabajador de la Isla Serrano. Con ello los indígenas tributarios abandonarian la region.

Diversas epidemias tambien asolaron Tarapacá en 1717, 1758. En 1804 la fiebre amarilla causó la muerte de catorce residentes de Iquique, obligando al resto de la población a marcharse. En 1809 la poblacion habia subido de 40 a 100 personas en dos barrios: La Puntilla para extranjeros y El Morro para indígenas y mestizos. Con esa cantidad de personas se mantedria el puerto durante más de dos siglos.

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